アルカリゲネス フェカリス AGS3 およびパエニバチルス ポリミクサ S4 ペクチナーゼによってリンゴ廃棄物から生成される不飽和オリゴガラクツロン酸の生物活性の研究

Scientific Reports volume 12、記事番号: 15830 (2022) この記事を引用

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1 オルトメトリック

メトリクスの詳細

ペクチンは果物の主要な構造成分の 1 つであり、α (1-4) 結合を持つ d-ガラクツロン酸単位で構成される難消化性の繊維です。 この研究では、リンゴ廃棄物中のペクチンの微生物分解と生物活性化合物の生成を調査します。 まず、ペクチン分解細菌を単離・同定し、DNS によりペクチン分解活性を評価しました。 製品は TLC および LC-MS-ESI によって評価されました。 抗酸化効果はDPPHを使用して調査され、抗癌効果と細胞毒性はMTTとフローサイトメトリーで分析されました。 この研究では、ペクチン分解酵素を有する 2 つの新しい細菌分離株、アルカリゲネス フェカリス AGS3 およびパエニバチルス ポリミクサ S4 が導入されました。 構造分析により、酵素分解の生成物には、A. フェカリスと P. ポリミクサ S4 のそれぞれ 40 mg/mL で 74% と 69% の RSA を含む不飽和モノ、ジ、トリ、ペンタ ガラクツロン酸が含まれることが示されました。 ＭＴＴアッセイによるＭＣＦ－７細胞に対する抗腫瘍特性の結果は、４０ｍｇ／ｍＬのＡＧＳ３およびＳ４の生成物について、４８時間後にそれぞれ７％および９％の生存を示した。 フローサイトメトリー評価では、40 mg/mL の AGS3 化合物は 48 時間で 100% 致死性であり、S4 分離株に関しては 98% が死亡しました。 L-929 細胞に対する細胞毒性評価では、生細胞に対して顕著な毒性は示されませんでした。

地球の人口が増加するにつれて、栄養ニーズを満たすための食料生産の増加は常に人間社会の主要な関心事の 1 つです。 この生産量の増加は、制御されない都市化や適切な廃棄物管理やリサイクル方法の欠如などの要因と相まって、環境中に廃棄物の蓄積をもたらし、取り返しのつかない環境破壊を引き起こします1。 国連食糧農業機関 (FAO) によると、世界の果物と野菜の生産量は 17 億 4,000 万トンを超え、その 10 ～ 50 パーセントがさまざまな国で廃棄されています。 世界の食品廃棄物の価値は年間 1 兆米ドルと推定されています。 これほどの量の廃棄食品を生産するために使用される資源は、年間 4.4 ギガトンの温室効果ガス (CO2 に相当) を排出しており、廃棄食品は中国と米国に次いで世界で 3 番目に多くの温室効果ガスを発生させています2。

食品ロスの程度は、製品の種類、経済発展のレベル、地理的領域の社会的および文化的条件に応じて、生産チェーンのさまざまな段階で異なります。 FAOの調査によると、果物と野菜の場合、収穫、選別、等級分けの段階での廃棄が工業地帯で主に発生しています。 発展途上地域では、収穫、選別、格付け段階での食品ロスが多い一方で、加工段階での廃棄量（14～21％）は先進地域（2％未満）よりもはるかに多い2,3。 これにより、ほとんどの果物製品は消費前に加工されるため、価値が高まるだけでなく、市場に出回る果物の品質と数も維持されます4。 処理中に大量の廃棄物が蓄積するため、環境への悪影響を軽減するための処理に高額なコストがかかります5、6。 したがって、果物加工廃棄物は、重大な環境破壊を意味する大量の食品廃棄物の原因となるだけでなく、価値の高い栄養素の損失を意味します7。 したがって、廃棄物を付加価値のある製品に変換することは、食品サプライチェーンの持続可能性と効率を向上させるために重要かつ必要です8。

長年にわたる数多くの研究では、酵素、バイオエタノール、有機酸、ヘテロ多糖類、芳香族化合物、タンパク質強化飼料、プレバイオティックオリゴ糖、生物活性化合物などの果物廃棄物の微生物変換または酵素処理による付加価値製品の生産が行われてきました。 、調査されています9。 残留果実繊維の微生物処理は、天然の有益なオリゴマーの合成のためのモノマーとして廃棄物を使用する比較的新しいアプローチです10。

一般に、果物の構造は、異なる特性を持つさまざまな化合物で構成されています。 水分の次に最も多く含まれるのは炭水化物で、ほとんどの果物では乾燥重量の 50 ～ 80% を占めます 11。 果物廃棄物に含まれる多くの炭水化物は食物繊維の一種であり、その化合物の最大 40% がペクチンです。 ペクチンは、植物の一次細胞壁に豊富に含まれる高分子量の酸性多糖類のファミリーであり、主にα (1-4) 結合をもつ主鎖の d-ガラクツロン酸単位と、細胞内に少量のラムノースから作られています。主鎖と側鎖のアラビノース、ガラクトース、キシロース10、13。 いくつかの研究で、食品および製薬産業におけるペクチンの応用が実証されています。 研究では、短鎖ペクチンにはプレバイオティクス、抗がん剤、薬物送達システム、ラジカル消去特性、コレステロール低下などの幅広い用途があり、それらの特徴はペクチン化合物の構造と分子量に関連していることが示唆されています10。 、14．

ラジカル種は、慢性閉塞性肺疾患（COPD）、喘息、糖尿病、炎症、心血管疾患、心筋梗塞と関連しています。 製造工程で一般的に使用される合成抗酸化剤は、細胞毒性の原因であると考えられています。 一方、天然多糖類は、フリーラジカルを除去し、健康上の懸念を引き起こす合成物質を克服できる信頼できる抗酸化物質であると考えられています。 ラムノガラクツロナン I を豊富に含む化合物、および主鎖のホモガラクツロナン、側鎖のラムノガラクツロナン I およびアラビノガラクタンからなる化合物は、最高レベルの抗酸化特性を示します。 したがって、ペクチン化合物の抗酸化特性は、ラムノガラクツロナン I、ホモガラクツロナン、アラビノガラクタンの構造に由来していると考えられます15。 さまざまな処理によって修飾されたペクチン由来のオリゴガラクツロン酸も、スーパーオキシド陰イオン、ヒドロキシル、活性酸素種などの化合物を精製できます。 また、スーパーオキシドジスムターゼ、カタラーゼ、グルタチオンペルオキシダーゼなどの酵素の抗酸化特性も高め、グルタチオンの量を増やすことで抗酸化特性を示します16。

ペクチンのもう 1 つの有望な生物学的活性は、発がんの予防および軽減における潜在的な役割です。 「変性ペクチン」のプラスの効果は、変性柑橘類ペクチン (GCS-100、FPP、またはペクタゾールなど) などの市販製品の形であっても、研究室で変性されたペクチンであっても、研究され証明されています。 特に柑橘類修飾ペクチン (MCP) は、これまでも広範な研究が行われてきました 17。 この用語は、高温、高 pH、または酵素分解で処理された柑橘類の皮および果肉から生成されるペクチンに由来する水溶性多糖類を表すために使用されるため、すべての MCP が同じというわけではありません。 pH 調整された柑橘類ペクチンは分子量が低く、市販の柑橘類ペクチンに由来しており、転移促進タンパク質ガラクチン-3 に結合して腫瘍細胞の転移を阻害できるガラクトースに富んだ側鎖を持っています。 ガラクチン-3 は、腫瘍細胞の増殖やアポトーシスなど、いくつかの細胞内生理学的および病理学的プロセスにおいて重要な役割を果たしています。 MCP のガラクチン-3 への結合は、腫瘍細胞の接着と遊走を促進し、アポトーシスを防ぐ能力を阻害するなど、ガラクチン-3 の負の効果を阻害する可能性があります。 ガラクトースが豊富な側鎖に加えて、ペクチンのホモガラクツロナン部分にも抗がん活性があります。 ガラクツロン酸が豊富な低分子量ペクチン断片（1 kDa）は、マウスおよびヒトのがん細胞に吸収され、これらの細胞の増殖を阻害し、がん細胞から乳酸デヒドロゲナーゼとガラクチン-3 を放出させました。 ガラクチン-3 との相互作用に加えて、修飾ペクチンのその他の潜在的な抗がん効果が in vitro および in vivo 条件の両方で報告されています 18。 オートクレーブ加水分解または加熱と酵素加水分解の組み合わせによって生成される低分子量柑橘類分別ペクチン粉末 (FPP) も、アンドロゲンおよびアンドロゲン非依存性前立腺がん細胞のアポトーシスを誘導します。 ペクタゾールの酵素分解によって生成される MCP は、前立腺がん細胞のアポトーシスを誘導し、前立腺がんの治療に使用されるさまざまな治療を受けている患者の前立腺特異抗原 (PSA) の倍加時間を増加させました。 酵素的に加水分解された柑橘類ペクチンは、さまざまな種類のがんの進行腫瘍患者において、臨床上の利点、生活の質の向上、および痛みの軽減をもたらすことも示されています19。

ペクチンは、酵素加水分解、酸加水分解、水熱処理、高圧微細流動化、または TiO2 含有媒体中での光化学反応などのさまざまな分解方法により、ペクチンオリゴ糖 (POS) に分解できます 10,20。 酵素法には、他の方法に比べて次のような大きな利点があります。(1) 反応は穏やかな操作条件下で行われます。(2) 加水分解媒体は腐食を引き起こしません。(3) 有毒または汚染化学物質は使用されません。(4) 加水分解は使用されません。酵素触媒反応で予想されるように、選択的で特定の構成単位または結合のみに影響を与えます。 (5) 反応効率は化学的方法で達成できるものよりも高い可能性があり、(6) 望ましくない生成物の生成が回避されます21。 ペクチン分解酵素は、(a) ペクチン メチル エステラーゼを含むエステラーゼ、および (b) 加水分解酵素およびリアーゼを含むデポリメラーゼの 2 つの主なグループに分類されます22。 多くの真菌種は、さまざまなペクチン分解酵素を生成することによってペクチンを分解できます。 研究により、Alternaria sesami は、ポリガラクツロナーゼ トランスエリミナーゼ、ペクチン トランスエリミナーゼ、ポリガラクツロナーゼなどのペクチン分解酵素を生成することが示されています 23。 Elrod は、Erwinia 細菌がペクチンを分解する可能性があることを初めて報告しました 23。 Zucker et al.24 および Chatterjee et al.25 は、Pseudomonas fluorescens および Erwinia による細胞外エンドポリガラクツロナーゼの誘導産生を実証しました。

ベータプロテオバクテリアクラスのアルカリゲネス科のメンバーであるアルカリゲネス・フェカリスは、バイオテクノロジー、食品および健康産業で多くの用途があります。 アルカリゲネス属プラスチック状の貯蔵物質、酵素、多糖類の製造に使用され、さらに食品添加物としてアミノ酸の商業生産にも使用されています26。

パエニバチルス ポリミクサは、バチルス綱のパエニバシラ科のメンバーとして、さまざまな生理学的および生物工学的プロセスに関与しています。 この細菌のさまざまな株は、土壌中の窒素固定、抗生物質の生産、およびリンの可溶化に使用できます。 P.ポリミクサは、加水分解経路で細胞壁分解酵素を生成することが知られています。 P. ポリミクサのさまざまな株が、二次代謝産物としてバイオ産業で幅広い用途を持つエキソ多糖類 (EPS) を生成することが報告されています 27。

現在の研究では、A.フェカリス、AGS3、およびP.ポリミクサS4が分離および同定されました。 この研究の目的は、分離された細菌分離株 A. フェカリス AGS3 および P. ポリミクサ S4 のペクチナーゼによるペクチンの微生物分解を調査し、初めて生成物を同定し、得られた化合物の抗がん性および抗酸化特性を調査することでした。

AGS3、グラム陰性、非抗酸性、好気性、棒状、カタラーゼ陽性、オキシダーゼ陽性、クエン酸陽性、運動性、および S4 グラム陽性、非抗酸、好気性、棒状、カタラーゼ陰性、オキシダーゼ陰性、クエン酸陰性、および非運動性（図1b）は、それらの明確なハロー領域半径（図1a）に従って選択されました。 両方の分離株の最適な増殖条件は 30 °C、pH 6.8 ～ 7.0 でした。 最尤法を用いて系統解析を行った結果、分離株AGS3はプロテオバクテリア門アルカリゲネス科アルカリゲネス属に属し、S4はファーミクテス門パエニバシラ科パエニバチルス属に属することが判明した（図1）。 1c)。 さらに、BLAST分析により、AGS3およびS4分離株がそれぞれアルカリゲネス・フェカリスおよびパエニバチルス・ポリミクサ種に属することが明らかになった。 今後、分離株 A. フェカリス AGS3 (MZ093052) および P. ポリミクサ S4 (MZ596260) の配列が、国立バイオテクノロジー情報センター (NCBI) の GenBank に提出されました。

(a) 選択した細菌分離株、AGS3 および S4 の周囲のハロー領域。ポリガラクツロン酸の分解によるペクチン分解活性を示します (黄色のハロー領域)。 (b) AGS3 および S4 細菌分離株の顕微鏡画像。 （c）A.フェカリス分離株AGS3とP.ポリミクサ分離株S4の系統関係。 このツリーは、1000 個のブートストラップを使用した最尤法を使用して MEGA 11 ソフトウェアで構築されました。

アルカリゲネス・フェカリスは、亜硝酸塩による嫌気性呼吸と、ポリ-(3-ヒドロキシ酪酸) (PHB) などの微生物貯蔵ポリマーの分解で最もよく知られています。 A.フェカリスは、非標準アミノ酸の生産にも使用されています。 A. faecalis は、植物廃棄物の生分解に使用できるさまざまな加水分解酵素を持っていることが認識されていますが、その可能性に関する研究にはさらなる進歩が必要です 26。

パエニバチルス ポリミクサは、多種多様な二次代謝産物を生成することが知られており、これによりさまざまな環境ストレスに耐えることができ、農業および工業プロセスにおいて有利なバイオテクノロジー物質となっています。 P. ポリミクサは窒素固定能力に加え、植物成長調節因子、加水分解酵素、抗生物質化合物の産生を持っています。 P.ポリミクサ株は、プロテアーゼ、β-1,3-グルカナーゼ、セルラーゼ、キシラナーゼ、リパーゼ、アミラーゼ、キチナーゼ、およびペクチナーゼを含むいくつかの加水分解酵素を産生することで知られている。 したがって、さまざまな研究で、廃棄物管理および廃水処理における P. ポリミクサ株の能力が調査されました。 しかし、P. ポリミクサ酵素の加水分解活性によって生成される化合物はまだ同定されておらず、さらなる研究が必要です27。

DNS 試薬を使用したペクチン分解アッセイを使用して、A. フェカリス AGS3 および P. ポリミクサ S4 分離株のペクチナーゼ活性によって生成されるペクチン オリゴ糖 (POS) の数を測定しました。 POS放出の最高収率を測定した結果、A.フェカリスAGS3（図2a）およびP.ポリミクサS4（図2b）分離株は、30℃で20時間および4時間インキュベートした後に放出された糖の濃度が最大になることが示されました。それぞれC、180rpm。

ペクチン培地中、(a) A. フェカリス AGS3 分離株、および (b) P. ポリミクサ S4 分離株から放出されるペクチン オリゴ糖の量をモニタリングします - 30 °C 180 rpm。

最終的に、得られた POS は凍結乾燥され、さらなる分析のために保管されました。

薄層クロマトグラフィー (TLC) を実行して、分離株によるペクチンの分解を検証しました。 TLCパターンにより、両方の分離株においてペクチンがPOSに分解されたことが確認されました（図3a）。 生成されたオリゴガラクツロン酸のさらなる分析は、凍結乾燥サンプルの LC-ESI-MS によって実行されました。 A.フェカリスAGS3およびP.ポリミクサS4分離株生成物画分のLC-ESI-MS質量スペクトルは、両方の分離株のペクチン分解の酵素生成物中に異なるタイプのオリゴガラクツロン酸が存在することを示しました（図3b、c、表1） ）。 最終的に、モノガラクツロン酸と不飽和モノ、ジ、トリ、ペンタガラクツロン酸の形態が同定されました。 ペクチン分解酵素にはさまざまな種類があります。 その中で、ペクチンリアーゼによって行われる反応は不飽和オリゴガラクツロン酸を生成するため、この研究で得られた生成物を考慮すると、A. faecalis AGS3およびP.polymyxa S4分離株のペクチン分解活性はペクチンリアーゼ酵素によるものであると推測されます。

(a) 分離株のペクチン分解活性から得られたサンプルの TLC 評価パターン、S1: グルコースの標準溶液、S2: A. faecalis AGS3 から得られたペクチン性オリゴ糖、S3: P. ポリミクサから得られたペクチン性オリゴ糖 S4、S4: グルコースの標準溶液モノガラクツロン酸; （b）A.フェカリスAGS3、および（c）P.ポリミクサS4によるペクチン分解から得られたサンプルのLC-ESI-MS質量スペクトル。

一般に、報告されているペクチナーゼのほとんどは、アスペルギルス、アルタナリア、ペニシリウムなどの真菌に属します28、29、30、31。 それにもかかわらず、細菌内にさまざまな種類のペクチン分解酵素が存在することを示す報告がいくつかあります。 たとえば、Acinetobacter guillouiae、Kosakonia sacchari、Bacillus vallismortis がポリガラクツロナーゼを持っていることが報告されています。 ペクチンおよびペクチン酸リアーゼは、Streptomyces、Actinomycetes、Pseudomonas、および Bacillus 種に存在することが証明されています 31,32。 Xanthomonas compestris、Ervinia chrysanthemi、Colletotrichum lindemuthianum、Pseudomonas siringea、Phytophthora capsici などの内部寄生性病原体には、ペクチン分解活性があることが報告されています 31。 研究によれば、サルモネラ菌や大腸菌などの一部の腸内病原体は、ペクチン分解酵素を欠いているにもかかわらず、ペクチン分解によって生じるオリゴマーを利用できることが示唆されています10,31。 我々は、この研究がA.フェカリスとP.ポリミクサのペクチン分解活性から得られる化合物を同定した最初のものであると信じている。

得られた POS のラジカル消去活性 (RSA) を DPPH 試薬によってテストしました。 1.25 ～ 80 mg/mL の濃度範囲での結果から、POS の抗酸化効果は濃度を上げるほど高くなることがわかりました。 A. faecalis AGS3 分離株から得られた POS の RSA は、1.25 ～ 80 mg/mL の濃度で 18 ～ 81% の範囲であり、P. ポリミクサの結果は、同じ濃度で 13 ～ 74% の RSA の範囲を示しました (図 4)。 ）。

DPPH試薬によるペクチン分解により得られるオリゴ糖の抗酸化特性の評価。

酸化ストレスは、酸化促進物質と抗酸化物質の間のバランスの喪失に関連する概念であり、一般的な病気の生理機能に関連しています。 抗酸化物質は、生細胞に悪影響を与える活性酸素を中和する役割を果たします33。 Yeung ら 34 は、フェントン反応を使用してオクラ ペクチンを加水分解し、得られた POS の抗酸化活性が濃度依存性であることを発見しました。 Streptomyces ヒドロゲナーゼ YAM1 の酵素的加水分解によって得られた POS の DPPH アッセイの結果は、RSA が高濃度で増加することを示しました。 Hosseini Abari et al.10 はまた、酵素的に修飾されたペクチンが未処理のペクチン多糖類と比較してより高い抗酸化活性を有することを実証しました。 同様の研究は、POS の抗酸化活性の用量依存性を裏付けています。 この研究では、図6に示すように、濃度によるサンプルの抗酸化特性の増加に関して、A.フェカリスAGS3およびP.ポリミクサS4から得られたサンプルの80mg/mLで最も高いRSAが報告されました。 20 mg/mL の POS では、P. ポリミクサ S4 で 59%、A. フェカリス AGS3 で 69% という結果が得られ、Hosseini Abari et al. で述べられているように、ポリガラクツロン酸と比較して RSA が 20 ～ 30% 増加しました。 勉強10． これらの結果は、以前の研究によるペクチン多糖類の抗酸化活性の結果と比較して、POS の RSA が大幅に増加していることを示しています。 これは、A. faecalis および P. Polymyxa 種の製品における RSA の最初の報告です。

MTT アッセイおよびフローサイトメトリーによって行われた評価では、P. ポリミクサ S4 および A. フェカリス AGS3 分離株のペクチン分解酵素を使用してリンゴ廃棄物から得られた POS について、MCF-7 細胞に対する顕著な抗がん活性が示されました。 図 5 で述べたように、MTT アッセイの結果は、A. フェカリス AGS3 および P. ポリミクサ S4 から得られた 40 mg/mL の POS で、48 時間のインキュベーション後にそれぞれ 93% および 91% の最大細胞生存率減少を示しました。 最小の細胞生存率減少は、A.フェカリスAGS3およびP.ポリミクサS4についてそれぞれ17%および37%で24時間処理した後、1.25mg/mLのPOSで得られた。

(a) 24 時間および (b) 48 時間の処理後の MCF-7 細胞の MTT 評価。

同様に、48 時間のインキュベーション後に得られた POS の 5 および 40 mg/mL でのフローサイトメトリー分析の結果は、アポトーシスの誘導を実証しました。A. フェカリス AGS3 では 84% と 100%、P. ポリミクサ S4 では 90% と 98% (図6b)。 図6bでは、M1ゾーンはPI試薬で染色されていない生細胞の分布を表し、M2ゾーンはPI試薬で染色された死細胞を示しています。 図6aに見られるように、処理された細胞も形態学的変化を受けました。

5 および 40 mg/mL の POS で得られた A. フェカリス AGS3 および P. ポリミクサ S4 で 48 時間処理した後の MCF-7 の細胞生存率の結果。(a) は、対照 (未処理) 細胞と比較した処理細胞の形態学的側面を示し、 (b) は、対照 (未処理) 細胞と比較した、処理細胞のフローサイトメトリー分析を示しています。

世界の重大な健康問題の 1 つであるがんには、発がん物質と呼ばれる多数の生理学的および生化学的誘発物質が存在します。 化学療法で使用される合成薬剤の大部分は、非がん細胞に対する副作用があり、がん細胞の薬剤耐性を引き起こすため、患者にとってさらなる問題を引き起こす可能性があるため、高い抗がん作用を持つ天然化合物の使用が優れた解決策となっています10、13、35。 。 研究によると、酵素的に加水分解された柑橘類ペクチン断片は、14 か月の治療後に血清 PSA を 50% 減少させ、増殖性前立腺がんの進行に影響を与える可能性があることが示されています。 酵素処理された柑橘類およびリンゴのペクチンは、ヒトの腸がん細胞の増殖を阻害し、アポトーシスを誘導する可能性があることが証明されています19。 低分子量修飾アップルペクチンは、インビトロでヒト結腸直腸癌細胞（HT-29）の結腸直腸腫瘍およびマウスの大腸炎関連結腸直腸癌の細胞周期を阻害します36。 同じ低分子量リンゴペクチンはマウスの結腸癌腫瘍のリスクを軽減し、ガラクチン-318に結合することが報告されました。 単糖組成の検査により、ガラクツロン酸が修飾ペクチン構造の主成分であり、その中にはガラクトースが少量しか検出されなかったが、単糖組成はペクタゾール単糖の組成と類似していることが示された。 MCP はガラクトオリゴ糖が豊富ではないかもしれませんが、オリゴガラクツロン酸と比較して小腸で選択的に吸収されます 37。 Delphi らの研究では、 MDA-MB-231 がん細胞では、POS による治療によりアポトーシスが誘導され、がん細胞の生存率が低下しました 38。 Li らによる HT29 癌細胞株に対するペクチンオリゴ糖とペクチン多糖の効果を測定した結果 39 では、POS はペクチンよりもはるかに低い濃度で癌細胞の阻害に効果があることが示されました。 Hosseini Abari ら 10 は、20 mg/mL POS で 24 時間処理した後の MCF-7 細胞株のアポトーシスが 92% であることを実証しました。これは、同じ濃度でのペクチンの効果よりも有意に高かったです。 以前の結果を裏付けるように、我々の研究では、P. ポリミクサ S4 サンプルと A. フェカリス AGS3 サンプルの両方に対して顕著な抗癌特性を示すオリゴ糖が得られました。 私たちの知る限り、P. ポリミクサおよび A. フェカリス種の製品の抗腫瘍特性に関するこれまでの報告はありません。

得られた POS の L-929 細胞に対する細胞毒性効果を、48 時間のインキュベーション後に MTT アッセイによって測定しました。 L-929細胞を5および40 mg/mLの得られた生成物で処理し、未処理の細胞を対照として使用した。 図7aで述べたように、分析では、A.フェカリスAGS3に対しては3％未満の死亡で、P.ポリミクサS4に対しては約2％の死亡で有意な毒性は示されませんでした。 図7bに示す処理細胞の形態により、MTTアッセイの結果が確認されました。

48時間のインキュベーション後のL-929細胞に対する得られたPOSの細胞毒性評価。 (a) 処理細胞の MTT アッセイ結果は、対照と比較して有意な細胞毒性を示さなかった。 (b) 処理した細胞の顕微鏡分析では、対照と比較して細胞の形態に変化が見られませんでした。

癌の治療に使用される薬剤の非癌細胞に対する細胞毒性は、化学向性治療における大きな懸念事項です。 Delphi らによる以前の結果とは反対です。 これは、HUVEC 細胞上の高濃度の POS に対する毒性を示しましたが、今回の研究では、L-929 細胞を 40 mg/mL の POS で 48 時間処理した後、有意な毒性は観察されませんでした 38。 私たちの情報によれば、A. faecalis および P. Polymyxa から得られた POS の細胞毒性を調査した他の研究はありません。

この研究の結果、2 つの新しい細菌分離株、アルカリゲネス フェカリス AGS3 およびパエニバチルス ポリミクサ S4 が分離および同定されました。 言及された分離株は、ペクチンをさまざまな不飽和ペクチンオリゴ糖に分解することができました。 この研究では、A.フェカリスおよびP.ポリミクサ種のペクチン分解活性から得られた化合物の生物活性が初めて調査され、その結果、生細胞に対して無毒であるにもかかわらず、著しく高い抗酸化作用および抗がん作用が示されました。 得られた化合物の絶妙な生物活性と、環境から果物の廃棄物を除去する能力により、それらは世界で増大する問題に対する優れた経済的および環境的解決策となります。

この研究では、リンゴのゴールデン デリシャス品種 (Malusdomestica) からの廃棄物が使用されました。 言及された廃棄物は、イラン、イスファハーン州、イスファハーンのバハール果物店の地元の果物市場から購入されました。 リンゴの皮をむき、3 mm の立方体に切り刻み、その後、刻んだリンゴの廃棄物 30 g を、レモン汁 (12.5 mL)、クエン酸 (0.1 g)、および蒸留水 150 mL からなる溶液に加えました。 混合物をヒーター上で３０分間沸騰させ、次いで綿布を通して濾過した。 室温まで冷却した後、濾過した溶液に96%エチルアルコール30mLを加え、4℃で1時間放置してゲル化させた。 ８００ｇで１０分間遠心分離した後、混合物の上清を廃棄した。 最終的に、抽出されたペクチンを含む沈殿物を凍結乾燥しました40。

土壌サンプルは分離源として 12 の異なる地域から収集されました。 サンプルをリンゲル液に溶解し、1時間よく混合し、その後、100 mLの蒸留水中に0.25 mLの1%クロトリマゾールを含む栄養寒天培地で培養しました。 次に、選択された分離株を、抽出ペクチン (0.5 g)、酵母エキス (0.1 g)、カゼイン由来のペプトン (0.5 g)、CaCl2 (0.2 g)、NaCl (0.2 g)、および寒天 (1.5 g) を含むペクチン寒天培地で培養しました。 100 mL の蒸留水に溶解します41。 30 °C で 24 時間放置した後、1% I/KI 試薬溶液をプレートに添加した結果として生じる透明なハロー領域の測定により、ペクチン分解コロニーを識別しました 42。 庭園土壌から AGS3 を分離し、森林土壌から S4 を選択して同定しました。 ユニバーサルプライマーペア、27F (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3') および 1492R (5'-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3') をそれぞれフォワードプライマーおよびリバースプライマーとして使用して 16S rRNA 遺伝子を増幅し、Bio Magic Gene によって配列決定手順を実行しました。 (BMG) 社、中国。 配列は GenBank、NCBI に提出され、MEGA 11 ソフトウェアの最尤木法を使用して進化的関係史が調査されました。 Streptomyces maltophilia YS4 株の 16S rDNA 配列をアウトグループ (MT071635.1) として使用しました。

ペクチンの分解は、3,5-ジニトロサリチル酸による還元糖の定量分析 (DNS 法) を使用して決定されました。 抽出ペクチン (0.5 g)、酵母エキス (0.1 g)、カゼイン由来のペプトン (0.5 g)、CaCl2 (0.2 g)、および NaCl (0.2 g) を 100 mL の蒸留水中に含むペクチンブロス培地に細菌分離株を接種した後、 、4 mL の細菌培地を 2 時間ごとに滅菌条件で抽出しました。 次いで、細菌塊を、２４００ｇで５分間遠心分離することによって培地から分離した。 1 mL の DNS 試薬を培養上清の入ったネジ蓋付きチューブに加え、反応チューブを 5 分間煮沸し、室温で冷却しました。 安定した色を得るために 1 mL の 0.5% 硫酸ナトリウムを試験管に加え、540 nm で吸光度値を読みました 43。

薄層クロマトグラフィー (TLC) を使用して、ペクチン分解生成物を検出しました。 サンプルとして培養上清１．５μＬ、標準液としてモノガラクツロン酸溶液１ｍＭ、グルコース１ｍＭ溶液（シグマ社より購入）をシリカゲル６０ Ｆ２５４（メルク社製）にスポットした。 クロマトグラフィーは、移動相としてn-ブタノール/酢酸/水(2:1:2)中で3回実施した。 シリカゲル上の乾燥スポットの視覚化は、オルシノール/硫酸試薬(10 mLの70%硫酸中に8 mgのオルシノール)を噴霧することによって実行されました。 次に、プレートを 100 °C で 10 分間加熱しました32。

得られたペクチン分解生成物は、LC-ESI-MS によって分析および同定されました。 各サンプル 2 mg を 100 μL の蒸留水に溶解し、サンプルの可溶性画分を調査しました。 調査は、移動相として水とアセトニトリルの混合物 (90:30) を使用して定組成的に実施し、流速は 0.3 mL/min に設定しました。 四次送液ポンプ、サーモスタット付きカラムコンパートメント、脱気装置 (Agilent Technologies、ドイツ)、および 20 µL サンプルループを備えた Rheodyne 7725i 手動インジェクターバルブ (米国カリフォルニア州 Cotati) で構成される Agilent 1100 シリーズ LC システムを使用しました。サンプルを調製し、Agilent MassHunter Workstation B.01.03 によって実行される Agilent 6410 トリプル四重極質量分析計 (Agilent Technologies、米国カリフォルニア州パロアルト) を使用して質量分析を実行しました。 イオン化は、キャピラリー電圧 4000 V のネガティブ モードのエレクトロスプレー イオン化 (ESI) を使用して達成されました。ネブライザー ガスとして窒素を使用し、ネブライザー圧力 40 psi、ソース温度 100 °C で行いました。 窒素を 300 °C に加熱し、10 L/分の流量で供給しました。 サンプルのフラグメント電圧は 280 V、滞留時間は 200 ms でした。 検体はスキャン モード 32 を使用して検出されました。

得られたペクチンオリゴ糖の抗酸化効果を、1.25～80 mg/mLの範囲の様々な濃度で評価しました。 ０．５ｍＬのＰＯＳを２ｍＬの２，２－ジフェニル－１－ピクリルヒドラジル（ＤＰＰＨ）の０．２ｍＭメタノール溶液に添加した。 反応管を 25 °C の暗所に 30 分間置きました。 その後、サンプルの吸光度を 517 nm で検査しました。 反応の対照は0.2 mM DPPHであり、60% エタノールをブランクとして使用した。 測定された吸光度に基づいて、ラジカル消去活性 (RSA) を式 (1) によって計算しました。 (1)44:

ヒト乳がんの MCF-7 細胞株 (イスファハン大学細胞バンクから入手) を、10% ウシ胎児血清 (BioIdea) および 1% ペニシリンを含むダルベッコ改変イーグル最小培地 (DMEM; BioIdea) で作られた COM 培地で培養しました。 –ストレプトマイシン溶液（Sigma、米国）45。

MTT ((3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニル テトラゾリウム ブロミド) アッセイを使用して細胞生存率を分析しました。細胞を 10,000 細胞/個の密度で 96 ウェル培養プレートに播種しました。ウェルに静置し、CO2 インキュベーター内で 37 °C、5% CO2、湿度 95% で 24 時間インキュベートしました。翌日、細胞をリン酸緩衝生理食塩水 (PBS、pH 7) で洗浄し、5 および 40 mg/mL で処理しました。さらに、それぞれの時点で 20 μL の MTT 溶液 (5 mg/mL) をウェルに添加し、細胞を暗所の CO2 インキュベーター内で 4 時間インキュベートしました。培地を除去し、細胞によって形成されたホルマザン結晶を 100 μl のジメチルスルホキシド (DMSO) を使用して溶解し、マルチモードリーダーを使用して 570 nm で細胞生存率を測定し、式 (2)46 のように計算しました。

細胞を 24 ウェル培養プレート上に 1 ウェルあたり 100,000 細胞の密度で収集し、CO2 インキュベーター内で 24 時間インキュベートしました。 細胞をＰＢＳで洗浄し、５ｍｇ／ｍＬ濃度および４０ｍｇ／ｍＬ濃度の得られたＰＯＳで２４時間および４８時間処理した。 以後、不死化細胞の検出にはヨウ化プロピジウム (PI、Sigma) が使用されるようになりました。 フローサイトメーター (Becton Dickinson FACS Calibur) を使用して細胞を評価し、CellQuest ソフトウェア 47 を使用して細胞の分布を分析しました。

L-929 マウス線維芽細胞を COM 培地で培養し、96 ウェル培養プレートにプレーティングしました。 24時間後、得られたPOSの5および40 mg/mL濃度を使用して細胞を24および48時間処理した。 その後、前述の MTT アッセイを実行して、得られた化合物の細胞毒性効果を分析しました 46。

この研究中に分析されたすべてのデータは、この公開された論文とその補足資料ファイルに含まれています。

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著者らは、イスファハン大学の細胞分子生物学および微生物学科での研修期間中に修士課程の学生に与えられた経済的支援について、イスファハン大学に感謝しています。

イスファハン大学、生物科学技術学部、細胞分子生物学および微生物学科、イスファハン、8174673441、イラン

ベナム アシュラフィアン & アフロゾサダット ホセイニ アバリ

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BA: データキュレーション。 正式な分析。 調査; 書き込み。 AHA: 監督。 方法論、執筆 - レビューと編集。

Afrouzossadat Hosseini-Abari への通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

シュプリンガー ネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

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転載と許可

Ashrafian, B.、Hosseini-Abari, A. アルカリゲネス フェカリス AGS3 およびパエニバチルス ポリミクサ S4 ペクチナーゼによってリンゴ廃棄物から生成される不飽和オリゴガラクツロン酸の生物活性の研究。 Sci Rep 12、15830 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41598-022-20011-2

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受信日: 2022 年 7 月 9 日

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公開日: 2022 年 9 月 22 日

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