強力な顕微鏡でモータータンパク質をかつてないほど詳細に捕捉

アマンダ・ハイトは、ユタ州モアブに住むフリーランスのライター兼編集者です。

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微小管上のキネシンと呼ばれる分子モーターの図。クレジット: Graham Johnson、Ron Vale/HHMI

超解像顕微鏡が登場するとほぼ同時に、科学者たちはそれをキネシンと呼ばれる分子モーターに向けました。これらのタンパク質は、分子燃料ATPによって駆動され、微小管と呼ばれるタンパク質ハイウェイに沿って貨物を往復させることによって、細胞分裂、細胞シグナル伝達、細胞内輸送などの重要なプロセスを推進します。研究者たちは長い間、これらのモーターがどのように機能するかを理解したいと考えてきましたが、視覚化するには、モーターの速度を落とすか、簡略化された生体外システム内でモーターを隔離する必要がありました。

Science 誌に同時に掲載された論文では、独立して研究している 2 つのチームが MINFLUX と呼ばれる超解像度ツールを使用して、生理学的に関連する ATP 濃度でのモーターをほぼリアルタイムで研究しました。最初の論文は、MINFLUX の発明者で、ドイツのゲッティンゲンにある複合科学マックス・プランク研究所 (MPI) とハイデルベルクにある医学研究 MPI に兼任しているステファン・ヘル氏が主導したもので、追跡するための新しい機器設計が使用されました。タンパク質を 3D で表示し、その動きの詳細を明らかにします1。 2つ目は、ハイデルベルクの欧州分子生物学研究所の生物物理学者ジョナス・リース氏が主導したもので、MINFLUXが生きた細胞の喧騒の中でもキネシンを追跡できることを初めて示した2。

「この技術が機能するには、さまざまなものが必要ですが、これらすべてが連携するのを見るのは楽しいです」と、カリフォルニア大学アーバイン校の生物医学エンジニアであるミシェル・ディグマン氏は言う。彼は画像化戦略を開発しているが、いずれの戦略にも関与していない。勉強。「これは、キネシンを非常に正確に追跡できることを示す概念実証のように思えました。そして、生細胞システムがあれば、それはさらに素晴らしいことになります。」

研究者らは、1985 年のこのタンパク質の発見直後からキネシンの動きの基礎を解明し始めましたが、超解像度ツールの出現により、新たなレベルの詳細がもたらされました。 2004年、研究者らはFIONA（1ナノメートル精度の蛍光イメージング）と呼ばれる技術を用いて、特大の靴を履いた高くねじれた茎のように見えるキネシンが微小管軌道上を「手をつないで」歩き、その微小管の軌道を移動させていることを示した。足は、一連のモンキーバーを横切る子供の手に似た動きをします3。しかし、FIONA は並外れた空間分解能を提供しましたが、科学者たちは、それを研究するのに十分なだけタンパク質の速度を低下させるために ATP を配給する必要がありました。過去 10 年間、研究者らはキネシンを追跡するためにゲルマニウム 4 または金 5 のビーズでキネシンにタグを付けましたが、これらの比較的かさばるタグにより、この方法がタンパク質の全可動域をどの程度再現しているかについては疑問が残りました。

ヘル氏と彼のチームが 2016 年に 6 MINFLUX を導入したとき、彼はそれが、2014 年のノーベル化学賞をヘル氏と分け合ったその前任者である誘導放出破壊 (STED) 顕微鏡法よりも進歩していると考えました。 STED は、励起レーザーに重ねられたドーナツ型の「ディプレッション」レーザーを使用して、従来の光の回折限界 (約 250 ナノメートル) 未満に蛍光領域を効果的に縮小します。対照的に、MINFLUX はドーナツ型レーザーを使用して、その中心に蛍光強度がゼロの点を作成します。このレーザーを動かすことで、研究者は生理学的に近い速度で蛍光分子の位置を正確に特定することができます。

スマート顕微鏡が一瞬の生物学を発見

3月に発表された新しい研究1で、ヘル氏のグループは、線形レーザーを焦点面の2方向に連続してパルスし、重複する蛍光強度が最も低い場所を見つけることでタンパク質の位置を特定するバージョンのMINFLUXをテストした。研究者らは、複数の測定値を組み合わせることで、ランナーの進路を地図に描くアプリのように、分子が微小管に沿って移動している場所を示す軌跡を作成することができた。

新しいMINFLUXは以前の反復よりもそれほど効果的ではなかったが、彼のチームはそれを使用して、それらと同様のATP濃度でキネシンの歩行速度が毎秒550ナノメートル、歩幅が16ナノメートルであると推定することができたとヘル氏は述べています。生きた細胞の中に見られます。研究チームは、タンパク質のさまざまな部分をタグ付けして追跡することで、各歩幅が 2 つの 8 ナノメートルのサブステップで構成されていること、およびキネシンの柄が移動に伴って回転し、その結果、わずかに右に回転する前進運動が生じることも示しました。著者らはまた、片足だけが微小管に結合している場合にはATPが取り込まれるが、両足が結合している場合にはATPが消費されることも発見し、これまで矛盾していた知見が解決された7,8。

リース氏と彼のチームは、キネシンの動きに別の観点からアプローチしました。彼らは、生細胞内のタンパク質を追跡するために、ヘル氏と共同設立したゲッティンゲンに本拠を置く会社であるアッベリオル社が開発した市販のMINFLUX装置を使用した。混雑し、刻々と変化する細胞環境により、グループの軌跡は最終的に少なくなったが、脇道歩きや失速、ある微小管から別の微小管へのホップを捕捉することができた。これらすべては、通常では回避できない障害物を回避するためのタンパク質による努力である。精製されたサンプルで見られます。「それ以外の点では、私たちはほぼ同じものを見ています。同じような歩行速度、同じ歩幅です」とリース氏は言う。「そして、生きた細胞で初めてそれらを測定できたのは良かったです。」

キネシンを研究しているがどちらの研究にも関与していないペンシルバニア州立大学ステートカレッジの生物医学工学者ウィリアム・ハンコック氏は、この研究を「かなり信じられない」と呼んでいる。その結果は、過去の研究と大部分が一致しており、そのほとんどすべてが精製されたモータータンパク質を使用して試験管内で行われたものである、と彼は指摘する。「そこで非常に具体的な答えが得られますが、細胞の内部まで推定できるのは素晴らしいことです。これは本当に力作です。」

とはいえ、MINFLUX が「まだパフォーマンスの限界に達していない」ことは明らかです。サブナノメートルの空間分解能を達成したにもかかわらず、MINFLUX がまだ改善できる領域の 1 つは時間パフォーマンスにあると彼は言います。どちらのグループも最大 1 ミリモルの ATP 濃度で作業しましたが、平均的な細胞には 4 倍以上の ATP が含まれています。

こうした条件下でリアルタイムの時間分解能を達成するには、より優れた追跡システムが必要になる、とリース博士の研究で使用した色素を開発したハワード・ヒューズ医学研究所ジャネリア・リサーチ・キャンパス（バージニア州アッシュバーン）の有機化学者ルーク・ラビス氏は言う。「超解像度イメージングにおけるこの革命は、私たちが使用してきた多くのラベル付けや添付戦略が重要だったという事実に焦点を当てます」と彼は言います。「私たち全員の夢は、リンカーがほんの数個の原子であるタンパク質上の特定の場所に小分子蛍光体を結合できるようになることです。」標識を容易にするために合成アミノ酸をタンパク質に組み込む遺伝子コード拡張などの新しいツールは、この方向に進んでいるが、「すぐに使えるものには程遠い」と同氏は付け加えた。

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このような進歩により、特に研究者が一度に複数のタンパク質またはタンパク質内の複数の部位を追跡できるようになれば、複数の研究の道が開かれる可能性があります。今年、研究者らはまさにそれを目的とした RESI (Resolution Enhancement by Sequential Imaging) と呼ばれるツールを導入しました9。 RESI は、同じ標的分子の隣接するコピーを異なるタグで標識できるため、科学者は 1 ナノメートル未満の間隔にある分子を区別できるようになります。 RESI は現在、固定分子または静止分子に対してのみ機能しますが、その発見と非固定コピーの MINFLUX 追跡データを組み合わせることで、タンパク質の配置と運動に関する補完的な発見が得られる可能性があります。

Ries は他のモータータンパク質の研究に興味を持っており、彼の論文 2 で共有された補足実験では、筋肉収縮タンパク質であるミオシンに MINFLUX を適用しました。 2019年、ラビス氏は医薬品開発に単一分子追跡を使用する会社を共同設立した。他の科学者は、転写因子や DNA 結合タンパク質からコヒーシンやその他の分子モーターに至るまで、あらゆるものを将来の研究のターゲットとして提案しています。

しかし、カリフォルニア大学ロサンゼルス校のカリフォルニア・ナノシステム研究所の生物医学エンジニア兼プロジェクトサイエンティストであるヘイリー・マークス氏は、MINFLUXが真にアクセス可能で手頃な価格の「プラグアンドプレイ」システムになるまでには時間がかかるだろうと述べている。それまでの間、MINFLUX は仮想超解像度ツールに貢献することで、より広範なコミュニティに利益をもたらす可能性があると彼女は示唆しています。これらの人工知能アルゴリズムは、顕微鏡画像の大規模なコレクションをトレーニングして、従来の顕微鏡画像から超解像度画像を作成する方法を学習します。マークス氏は、結果として得られるデータは、「数百万ドルの顕微鏡を買う余裕がない人でも、はるかにアクセスしやすくなる」と述べています。

土井: https://doi.org/10.1038/d41586-023-01906-0

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